IGF-1 LR3 Liofilizowany

Wybór odpowiedniego szczepu ekspresyjnego ma kluczowe znaczenie dla ekspresji białka. Powszechnie stosowane szczepy ekspresyjne obejmują Rosetta (DE3), BL21 (DE3) itp. Szczepy te mają wydajne systemy polimerazy RNA T7 i mogą wydajnie wyrażać geny sterowane przez promotor T7.
Biorąc za przykład Rosettę (DE3), jej cechy charakterystyczne obejmują: zawieranie genu polimerazy RNA T7, indukowanego przez ekspresję IPTG. Przenoszące rzadkie geny tRNA kodonów mogą wydajnie wyrażać geny egzogenne zawierające rzadkie kodony. Nadaje się do ekspresji białek toksycznych lub białek trudnych do ekspresji.

Warunki ekspresji białka, takie jak stężenie induktora, temperatura indukcji, czas indukcji itp., mają znaczący wpływ na wydajność i jakość białka. Optymalizując warunki ekspresji, można zwiększyć poziom ekspresji IGF-1 LR3.
Stężenie środka indukującego: IPTG jest powszechnie stosowanym środkiem indukującym, o stężeniu zazwyczaj pomiędzy 0,1-1 mM. Określ optymalne stężenie IPTG poprzez eksperymenty gradientowe, aby osiągnąć najwyższy poziom ekspresji białka.
Temperatura indukcji: Temperaturę indukcji wybiera się zwykle w zakresie 16–37 stopni. Niższe temperatury (takie jak 16-20 stopni) mogą pomóc w zmniejszeniu degradacji białek i tworzeniu się ciał inkluzyjnych oraz zwiększyć wydajność białek rozpuszczalnych.
Czas indukcji: Czas indukcji wynosi zwykle od 2 do 24 godzin, a optymalny czas indukcji określa się na podstawie analizy poziomów ekspresji białka poprzez pobieranie próbek w określonym czasie.

WyrażenieIGF-1 LR3 Liofilizowanywykryto metodami SDS-PAGE i Western blot.
SDS-PAGE: Zbierz próbki bakterii przed i po indukcji, wykonaj fragmentację ultradźwiękową lub lizę chemiczną, odwiruj w celu oddzielenia supernatantu i osadu, a następnie wykonaj oddzielnie analizę SDS-PAGE. Porównując zmiany prążków białkowych w supernatancie i osadzie przed i po indukcji, potwierdzono ekspresję IGF-1 LR3.
Western blot: Użyj specyficznych przeciwciał (takich jak przeciwciała przeciwko znacznikowi His lub przeciwciała przeciwko IGF-1) do przeprowadzenia analizy immunoblot białek oddzielonych SDS-PAGE w celu dalszego potwierdzenia ekspresji i masy cząsteczkowej IGF-1 LR3.

Zbierz indukowane komórki bakteryjne i poddaj je lizie, aby uwolnić białka wewnątrzkomórkowe. Typowe metody krakowania obejmują fragmentację ultradźwiękową,-homogenizację pod wysokim ciśnieniem, kraking chemiczny itp. Biorąc za przykład fragmentację ultradźwiękową, kroki są następujące:
Pobieranie bakterii: Odwirować roztwór bakterii po indukowanej ekspresji w celu zebrania komórek bakteryjnych i ponownie zawiesić je w buforze do lizy (takim jak bufor PBS lub Tris HCl).
Fragmentacja ultradźwiękowa: zawiesinę bakterii umieszcza się w łaźni lodowej i rozdrabnia za pomocą urządzenia ultradźwiękowego, zwykle stosując-krótkoterminową metodę wielokrotnej fragmentacji (np. 10 sekund za każdym razem, w odstępie 10 sekund, powtarzane 10 razy), aby uniknąć denaturacji białka w wyniku przegrzania.
Separacja odśrodkowa: Odwirować pokruszoną zawiesinę bakterii w celu oddzielenia supernatantu i osadu. Supernatant zawiera rozpuszczalne białka, natomiast osad może zawierać ciałka inkluzyjne lub pozostałości komórek.

Ze względu na fakt, że rekombinowany IGF-1 LR3 zazwyczaj zawiera znacznik His, można go oczyścić za pomocą chromatografii powinowactwa do jonów niklu (Ni NTA).
Przygotowanie kolumny: Załaduj wypełnienie Ni NTA do kolumny chromatograficznej i zrównoważ je buforem równoważącym (takim jak PBS zawierający 20 mM imidazol).
Ładowanie próbki: Załaduj supernatant lizatu bakteryjnego na kolumnę chromatograficzną, umożliwiając IGF-1 LR3 ze znacznikiem His związanie się z jonami niklu.
Płukanie: Przemyć kolumnę chromatograficzną buforem do przemywania (takim jak PBS zawierający 50 mM imidazol) w celu usunięcia niezwiązanych lub słabo związanych białek zanieczyszczających.
Elucja: Użyj buforu do elucji (takiego jak PBS zawierający 250 mM imidazol) do elucji IGF-1 LR3 związanego z kolumną chromatograficzną i zbierz eluent.

Roztwór IGF-1 LR3 po elucji zawiera wysokie stężenie imidazolu, który należy usunąć poprzez etapy odsalania i zatężania, aby zwiększyć stężenie białka.

Odsalanie: Użyj kolumny odsalania lub worka dializacyjnego, aby usunąć imidazol z eluentu i zastąpić go odpowiednim roztworem buforowym (takim jak PBS).
Stężenie: Zatężyć odsolony roztwór białka za pomocą rurek ultrafiltracyjnych lub koncentratorów wirówkowych, aby zwiększyć stężenie białka do pożądanego poziomu.

Czystość i aktywność oczyszczonego IGF-1 LR3 wykrywano metodami SDS-PAGE, HPLC lub ELISA.
SDS-PAGE: Przeanalizuj czystość oczyszczonego białka i potwierdź, że nie ma wyraźnych pasm zanieczyszczeń.
HPLC: Użyj HPLC z odwróconymi fazami lub HPLC wykluczania wielkości w celu dalszej analizy czystości i rozkładu masy cząsteczkowej białek.
ELISA: Test immunoenzymatyczny (ELISA) służy do wykrywania aktywności biologicznej IGF-1 LR3, a jego poziom aktywności odzwierciedla stopień wiązania ze specyficznymi przeciwciałami.